Energiearme elektromagnetische Frequenzen bewirken
starke, reproduzierbare und nachhaltige Effekte
bei Zellen von Mensch und Tier

METHODEN

Zur Übertragung der Frequenzen wurden zwei Oszillatorgeräte der Reihe F-SCAN 2 verwendet, ein Prototypgerät und ein Seriengerät. Der Frequenzgenerator wurde mit einem Potentiometer mit 12 Stufen verbunden, der die Spannung der Frequenzen von 10V (maximale Ausgangsspannung) auf 0,8V, der Stufe 1, reduzierte. Der Potentiometer wurde an eine Verteilspinne mit parallel 6 je paarweisen Drähten von 1m Länge angeschlossen. Dies ermöglichte die parallele Behandlung von sechs Zellkulturen. Die Übertragung der EMF auf die Zellen erfolgte über sterilisierte Drähte von 0,4mm Durchmesser aus 24 Karat Gold. Die Goldelektroden wurden auf Glasplättchen von 10x26x1mm befestigt. Die Glasplättchen wurden aus Objektträgern für die Mikroskopie hergestellt. Es wurden zwei abgeplattete Golddrähte um die Enden der Glasplättchen gewickelt und mit Araldit so angeklebt, dass die Länge der freien Drahtenden 4cm betrug. Die Distanz zwischen den beiden Drähten betrug 1,8cm. Jeder Golddraht wurde in 2 bis 3cm Entfernung vom Glasplättchen mit isoliertem Zinndraht (Innendurchmesser 0,4mm) von 30cm Länge verbunden. Die Verbindungsstelle wurde durch eine 2cm lange Glaskapillare von der Umgebung isoliert und die Enden mit Araldit zugeklebt. Dies sollte ermöglichen, dass die EMF ausschliesslich über die Golddrähte auf das Medium übertragen wurden. Die beiden freien Enden der isolierten Drähte wurden durch ein unverschlossenes Loch neben der Membran des Deckels der Kulturflasche gezogen und für die EMF Behandlung mit einem Paar Kabel der Verteilspinne verbunden. Die Behandlung der Zellen erfolgte in 25cm² Falcon Zellkulturflaschen aus Kunststoff in nichtsteriler Umgebung bei Raumtemperatur. Die Kontrollkulturen ohne Frequenzbehandlung wurden für die gleiche Zeitspanne, die bis zu einer Stunde dauerte, ebenfalls auf Raumtemperatur gesetzt. Die Kontrollen waren ohne Elektroden. Nach der EMF Behandlung wurde die Drahtverbindung zur Spinne gelöst und die Kulturflaschen mit Elektroden und Zinndrähten wieder bei 37°C inkubiert. Es wurde für die EMF Behandlung darauf geachtet, dass die Glasplättchen flach auf dem Boden der Kulturflasche und vollständig in der Nährlösung lagen und dass die Länge des Golddrahtes über dem Medium mindestens 0,5cm betrug. Die Zellen wuchsen während der zwei monatigen Behandlungszeit um die Elektroden herum, zum Teil auch auf den Elektroden.
Die Frequenzbehandlungen der Zellkulturen wurden in Medium mit 1⁄4 der üblichen Serumkonzentration durchgeführt um das Wachstum der Zellen gering zu halten. Sobald die Kulturen konfluent oder dicht gewachsen waren, wurden die Zellen mit EDTA Lösung partiell resuspendiert. Etwa 10% der Zellen wurden in einer neuen Kulturflasche angesetzt und mit einer neuen sterilen Elektrode versehen. Die Zellgruppen wurden bei diesem Schritt nicht vollständig aufgelöst. Alle Zellarbeiten wurden in einer Sterilbench ausgeführt. Es gab Fälle von Kontamination, doch waren sie selten. Nach Abschluss der Frequenzbehandlungen wurden die Zellen für 10 Passagen unter Standardbedingungen bei 37°C kultiviert um sie wieder an das Standardmedium zu gewöhnen. Mikroskopische Untersuchungen waren während dieser zehn Passagen bereits möglich.
Insgesamt wurden 30 bis 35 EMF Behandlungen bei jedem Versuch durchgeführt. Die ersten 18 EM Behandlungen wurden jeden zweiten Tag durchgeführt, die folgenden jeden Tag. Vor jeder Frequenzbehandlung wurde ein Sweep für 2 Minuten über den ganzen Frequenzbereich der nachfolgenden emF durchgeführt. Mit Sweep wurde jede 1000. Frequenz im gewünschten Schwingungsbereich von 1,0 bis 6x10⁶ Hertz dreimal für Sekundenbruchteile angeregt. Durch die Anregung des EM Feldes der Zellen wird deren Sensibilität für die nachfolgend applizierten EMF erhöht. Bei Unterbrechungen von mehr als 1 Stunde Dauer zwischen Sweep und EMF Behandlung wurde der Sweep wiederholt.
Die EM Behandlung der Zellen umfasste jeweils 7 oder 8 Frequenzen: Die Frequenzgruppe A mit oder ohne Schlussfrequenz C und die Frequenzgruppe B (ohne Schlussfrequenz). Die Frequenzgruppe B war ursprünglich als Kontrollbehandlung gedacht gewesen. Die Frequenz C wurde nach Abschluss der gesamten Behandlung mit A an drei folgenden Tagen nur für sich, nach dem Sweep, aber ohne EMF A appliziert. Jede Frequenz wurde für jeweils 3 Minuten appliziert. Die Standardgruppe A umfasste folgende Frequenzen: 5'555'555,4Hz; 5'555'554,3Hz; 555'555,6Hz; 555'555,1Hz; 555,7Hz; 111,1Hz; 112,2Hz und Schlussfrequenz C mit 122,2Hz. Frequenzgruppe B: 5'555'556,9Hz; 5'555'556,2Hz; 555'554,0Hz; 555'553,2Hz; 556,7Hz; 109,2Hz und 110,0Hz. Die eigentliche Behandlungsdauer von Sweep plus EMF A betrug 23 Minuten.
Drei etablierte und eine primäre Zellinien wurden verwendet: 1) THP-1, menschliche Monozyten; diese Zellkultur stammt von einem Patienten mit akuter monozytischer Leukämie (erworben von ATCC; #TIB-202). 2) 3T3-L1 Maus Fibroblasten Zellen; Preadipocytenzellen (ATCC #CL-173). 3) B16-F1 Maus Melanoma Zellen (ATCC #CRL-6323). 4) Rafi; primäre Zellkultur von Rattenfibroblasten. Sie wurden von einer ein Tag alten Laborratte etabliert. THP-1, 3T3-L1 und B16-F1 sind krebsartige Zellen im Gegensatz zu den Rafi-Zellen. Die Rattenfibroblasten wurden nach den emF Behandlungen bei tiefer Sauerstoffkonzentration kultiviert um die Wahrscheinlichkeit von genetischen Veränderungen gering zu halten (Lit.2). Die Zellinien erhielten nach Abschluss der EMF Behandlung neue Namen. Nach A Frequenzen wurde THP-J, 3T3-J, B16-J und Rafi-J verwendet, nach den B Frequenzen die Namen 3T3-K und Rafi-K (siehe Tabelle 3).
Die EMF Behandlungen der Zellen wurden parallel mit mehreren Kulturflaschen durchgeführt (n = 2-4) und die gleichbehandelten Kulturen nach Abschluss der Behandlung vereinigt. Ausnahmen waren die 3T3-K1 und 3T3-K2, die Rafi und ein Teil der B16-F1 Zellen in den Experimenten zur Analyse der Melaninsynthese. Für die EMF Behandlungen betrug die Anzahl Zellen pro Ansatz für B16-F1 40 Zellen pro 25 cm2 Falcon Kulturflasche, 400 für THP-1 und 500 für 3T3-L1. Die Behandlungen erfolgten im Jahr 2005 und 2006 mit Ausnahme der B16-J Zellen für die Untersuchungen zur Melaninsynthese im 2007. Die Rattenfibroblasten wurden 2007 behandelt mit 400 Zellen pro Ansatz. Für Rafi und dem 2. Experiment mit B16 wurde der Ansatz von 2-4 auf 6 parallel behandelte Kulturflaschen erweitert, die nach Abschluss der EMF Behandlung nicht gepoolt wurden.
Kulturbedingungen: Die Zellkulturen wurden bei 37°C in Standardbrutschränken für Säugetierzellen bei 5% CO₂ gehalten. Wenn angegeben, wurden die Zellen in Stickstoff mit 1 bis 3% Sauerstoff und 5% CO₂ kultiviert. THP-1 Zellen wurden in RPMI Medium (Gibco 1640) mit 25mM Hepes, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 7,5% NBS nicht Hitze inaktiviert und 1mM Glutamax gehalten; 3T3-L1 Zellen in DMEM high Glucose Medium (Gibco) mit 25mM Hepes, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 10% NBS nicht Hitze inaktiviert und 1mM Glutamax; B16-F1 Zellen in MEM-Earle Medium (Biochroma) mit 25mM Hepes, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 8% NBS nicht Hitze inaktiviert, 1mM Glutamax und 1% Vitaminlösung (MEM non essential amino acids) eines 100x Stocks; Rafi in MEM high Glucose Medium (Gibco) mit 25mM Hepes, 50 units/ml Penicillin/Streptomycin, 5% NBS nicht Hitze inaktiviert und 1mM Glutamax. Die EDTA-Lösung bestand aus 10mM EDTA in phospatgepufferter isotonischer Lösung mit 0,1% BSA. Die serumfreie Zellkultivierung wurde in Ultraculture (12-725F) Medium von Cambrex mit 1mM Glutamax und 50 units/ml Penicillin/Streptomycin durchgeführt. Die PMA Stocklösung war in Chloroform gelöst bei einer Konzentration von 0,1mg/ml und wurde für die Behandlung der Zellen auf etwa 10ng pro ml Medium verdünnt.
Für die Wachstumsanalysen wurden verschiedene Zählmethoden verwendet: Am sensitivsten war die direkte Zellzahlbestimmung. Mit Hilfe eines Zählgerätes von Beckmann (Z2 Cell Coulter) wurde aus drei unabhängigen Proben mindestens 1000 Zellen gezählt und die durchschnittliche Zellzahl ermittelt. Es wurde bei allen Zellinien darauf geachtet, alle Zellgruppen mit EDTA Lösung vollständig und schonend in Einzelzellen aufzulösen um möglichst reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Die Resuspendierung der adherenten Zellen in der EDTA-Lösung bei 37°C dauerte bis zu etwa einer Stunde und ermöglichte es, die Zellgruppen danach durch wenig Pipettieren in Einzelzellen zu überführen. Die Zellzahl der resuspendierten Zellen blieb in der EDTA-Lösung mit BSA bei 4°C über 24 Stunden stabil.
Eine Vereinfachung des Wachstumsassays wurde angestrebt mittels Mikrotiterplatten mit 96 statt 12 oder 24 Wells. Dabei wird das Wachstum indirekt gemessen durch Messung der Farbintensität nach Methylenblaufärbung der fixierten Zellen. Der Wachstumsassay in Mikrotiterplatten ist zwar durch die Messung mit einem Plattenlesegerät weniger arbeitsintensiv als die direkte Zellzahlbestimmung. Er ermöglicht einen wesentlichen grösseren Durchsatz bei Triplikatbestimmungen. Er war jedoch deutlich weniger empfindlich: Ein Unterschied von 100% bei der direkten Bestimmung der Zellzahl verringerte sich beim Methylenblauassay je nach Anzahl Zellen pro Well auf 30% oder weniger. Die Reproduzierbarkeit des Methylenblauassay war gut. Es wurden viele Wachstumstest der 3T3, B16 und ein Teil der Experimente der Rafi Zellen mit Mikrotiterplatten durchgeführt trotz der geringeren Sensitivität.
Für statistische Auswertungen wurden Konfidenzintervalle mit einem P-Wert von 95% berechnet.
Die Fluoreszenzfärbung der DNA von Riesenzellen wurde mit DAPI (4’6-Diamino-2’-phenylindol-dihydrochlorid) durchgeführt.
Bestimmung der Überlebensrate: Zellen wurden resuspendiert und bei gleicher Zelldichte in EDTA Lösung bei 4°C aufbewahrt. Der Anteil lebender Zellen wurde nach jedem Tag durch Anfärben mit Methylenblau bestimmt.
Die Saateffizienz SE der Rafi Zellen wurde folgendermassen bestimmt: Zellen einer Kultur, die etwa 80% konfluent war, wurden in Einzelzellen resuspendiert und auf Eis aufbewahrt. Für die Bestimmung der SE wurden je 50’000 Zellen in 4 Wells einer 6 Wellplatte in MEM Medium mit 4% NBS und 1% FBS verteilt. Für die SE-Bestimmung wurden die Wells über Nacht bei 37°C mit 5ml PBS mit 0,1% BSA Lösung vorbehandelt, dann einmal mit MEM Medium gespült, danach 4ml Medium (vorgewärmt auf 37°C) pro Well für den Assay vorgegeben und die Platte auf 37°C gebracht. Nach 30 oder mehr Minuten wurden 50’000 Zellen in 1ml MEM Medium pro Well zugegeben und die Zellkulturen bei 37°C inkubiert. Wurden die SE-Werte mehrerer Zellkulturen an einem Tag bestimmt, wurde die EDTA-Menge pro Well ausgeglichen. Die Zellen, die nach 2 Stunden nicht sesshaft geworden waren, wurden mit dem Inkubationsmedium abgesaugt, die adherenter Zellen einmal gewaschen und ihre Anzahl bestimmt: 100'000 sesshafte Zellen ergaben demnach eine SE von 50%.
Der Wachstumsassay der Rafi Zellinien: Je 6000 Zellen wurden bei einem SE Wert von 35% pro Well der 24 Wellplatten angesetzt. Bei einem SE Wert unter 35% wurden entsprechend mehr, bei einem SE Wert darüber entsprechend weniger Zellen eingesetzt.